При поиске причин болезней и разработке новых методов лечения совершенно необходимо иметь точное понимание генетических основ. Исследователи из Вюрцбурга разработали для этой цели новую технику.
Патологические процессы обычно характеризуются изменением активности генов в пораженных клетках . Таким образом, получение точной картины активности генов может дать ключ к разработке новых целевых методов лечения. Будут ли эти методы лечения работать так, как мы хотели бы, также можно проверить, изучив гены и процессы, которые они инициируют.
Неудивительно, что исследования сосредоточены на методах и приемах, позволяющих получить подробную информацию о генетической активности отдельных клеток. Исследовательская группа из Вюрцбургского университета (JMU) разработала методику, которая является значительным улучшением по сравнению с методами, использовавшимися до сих пор. Были привлечены ученые из Института молекулярной биологии инфекций (IMIB) и Института исследований инфекций на основе РНК им. Гельмгольца (HIRI). Результаты своей работы они представили в текущем выпуске журнала Nucleic Acids Research.
Анализ синтетического транскриптома
«Мы разработали метод, который можно использовать для анализа трансляционного ландшафта полностью настраиваемого синтетического транскриптома, другими словами, вне клетки», — объясняет Йорг Фогель основной результат исследования. Фогель возглавляет Институт молекулярной биологии инфекций в JMU, а также является директором HIRI и основным автором исследования. Новый метод получил научное название INRI-seq, что является сокращением от in vitro Ribo-seq.
Транскриптом представляет собой совокупность всех генов, которые активны в клетке в данный момент времени. Он состоит из суммы существующих мРНК — переносчиков чертежей белков из клеточного ядра в рибосомы. Рибосомы — это «белковые фабрики» клетки; здесь происходит перевод нуклеотидной последовательности мРНК в аминокислотную последовательность белка.
Уточнение сопоставимых методов
В принципе, INRI-seq представляет собой усовершенствование сопоставимых методов, которые преследуют ту же цель, но дают менее точные результаты или имеют другие недостатки. Например, секвенирование РНК (RNA-seq) определяет концентрацию мРНК в клетках, что позволяет сделать выводы об их активных генах. Однако конечное содержание белка не всегда коррелирует с соответствующей концентрацией мРНК.
Более точным методом является профилирование рибосом (Ribo-seq). За последние десять лет это стало одним из основных методов измерения синтеза белка непосредственно в транскриптоме. «Хотя Ribo-seq значительно продвинул вперед изучение процессов, связанных с переводом, этот метод не лишен ограничений», — говорит Йорг Фогель.
Многочисленные ограничения Ribo-seq
Например, очень сложно обнаружить слабо экспрессируемые гены с помощью Ribo-seq, что предотвращает запись многих генов в обычных исследованиях. Точно так же исследование микробов из важных экологических мест обитания, таких как кишечник человека, с помощью Ribo-seq затруднено, поскольку многие из них нельзя культивировать в лаборатории.
Еще одним недостатком, как объясняет Фогель, является тот факт, что «на механистическом уровне исследования молекул, влияющих на трансляцию, таких как специальные антибиотики, на основе Ribo-seq, могут быть затруднены клеточными реакциями». Поскольку Ribo-seq выполняется на живых клетках, может быть трудно различить прямое и косвенное воздействие на трансляцию.
Чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, ученые из Вюрцбурга разработали INRI-seq для глобального изучения трансляции в бесклеточной среде. INRI-seq использует коммерчески доступную систему трансляции in vitro в сочетании с полностью настраиваемым транскриптомом, синтезированным in vitro, что позволяет лучше контролировать уровни отдельных мРНК.
«Например, благодаря INRI-seq веществам, модулирующим трансляцию, больше не нужно пересекать клеточные мембраны или извлекать рибосомы из большого количества живых клеток», — говорит Фогель, подчеркивая преимущества метода. «Вам также нужно гораздо меньше часто дорогостоящего вещества, которое вы хотите изучать, например, нового антибиотика, который можно производить только в небольших масштабах. Таким образом, INRI-seq также экономит время и деньги».
Более высокий уровень успеха в эксперименте
Исследовательская группа продемонстрировала, насколько хорошо работает система, используя синтетически созданный транскриптом бактерии Escherichia coli. По сравнению с технически аналогичным исследованием живых клеток INRI-seq выявил почти в четыре раза больше сайтов, где инициируются процессы трансляции, что демонстрирует его высокую чувствительность.
Поэтому Фогель и его команда не сомневаются в том, что «INRI-seq обладает большим потенциалом в качестве альтернативного метода изучения процесса трансляции и, следовательно, также веществ, которые могут влиять на эти процессы».
Теги: биотехнологии
